Replikation

Der Bau der DNA weist bereits auf ihre Vermehrung hin, da die DNA das Erbmaterial enthält und jede Zelle das gleiche Erbmaterial enthält muss die DNA zur vollständigen, fehlerfreien, identischen Verdopplung fähig sein, um bei Teilung den Nachfolgezellen das gleiche Erbmaterial mitzugeben. Da die beiden Stränge der DNA komplementär zueinander sind können, wenn sich beide Stränge voneinander lösen die selben komplementären Sequenzen zu beiden Einzelsträngen neu gebildet werden. Es entstehen so zwei völlig identische Doppelstränge. Diese bestehen aus je einem alten und einem neu gebildeten Strang. Man nennt diese Art der Verdopplung semi- konservative Replikation.

Daneben gibt es noch die konservative Reduplikation. Bei dieser lösen sich die neu gebildeten komplementär gebildeten Einzelstränge wieder voneinander und bilden untereinander einen neuen Doppelstrang, ebenso, wie die beiden alten Stränge und bilden auch wieder Wasserstoffbrücken und die Doppelhelix aus.

Schließlich gibt es noch eine dritte Art der Replikation, die Disperse. Hierbei bestehen Teile beider Doppelstränge aus semi- konservativen und konservativen Teilen in wechselnder Reihenfolge. Man vermutet, dass dies dadurch hervorgerufen wird, dass die DNA nicht immer nur vom 5'- Ende des codogenen Strangs her aufgeschnitten wird, sondern in manchen Fällen gleichzeitig an mehreren Stellen in der Mitte des Moleküls. Jede vollständige DNA enthält an beiden Enden mehrere hundert gleiche Tripletts. Sie werden Telomere genannt. Sie schützen die DNA offensichtlich bei Teilung und werden bei jeder Teilung in ihrer Zahl vermindert. Dadurch wird die DNA leichter geschädigt und es kommt zum Alterungsprozess.

Bei dieser Replikation sind eine Menge von Enzymen beteiligt. Dazu zählen Nukleasen (DNA-spaltende Enzyme), Polymerasen (Nukleotid-zersetzende Enzyme) und Reperaturenzyme (DNA-reparierende Enzyme). Zu den Nukleasen zählen auch die Restriktionsenzyme, welche nur bei Bakterien vorkommen und daraus gewonnen werden. Diese spalten DNA- Stränge an ganz spezifischen Bindungsstellen mit einer ganz speziellen Abfolge von 4- 10 Nukleotiden. Interessant sind dabei solche Restriktionsenzyme, die die doppelsträngige DNA so spalten, dass einsträngige Enden entstehen. Sie führen zu DNA- Stücken mit sticy ends (klebrigen Enden), welche für das Einführen von Genen in fremde DNA (Gentechnik) von großer Bedeutung sind.

Die entscheidenden Versuche zur Klärung der Replikation, insbesondere des semi- konservativen Verlaufs der Replikation, unternahmen Meselson und Stahl.

Die übliche Form der Replikation ist die semi- konservative. Den Beweis durch ein Experiment für diese Form der DNA- Verdopplung lieferten: Meselson und Stahl (Versuchsdarstellung S. 359- 360.

Die DNA ist in der Regel sehr stabil, sie kann aber in heißer NaCl- und HCl- Lösung gelöst werden. Erhitzt man langsam diese Lösung, kann man beide Stränge voneinander trennen, ohne dass Schäden an der DNA entstehen. Kühlt man dann wieder langsam ab, treten beide komplementären Stränge über Wasserstoffbrücken zum DNA- Doppelstrang zusammen. Kühlt man sehr schnell ab, bleiben die Stränge vereinzelt und können nun getrennt werden (durch Dichtegradienten. Zentrifugation, oder durch Gel- Elektrophorese). Mit solchen einsträngigen DNA- Hälften kann man wichtige Untersuchungen in der Medizin, Kriminalistik und Evolutionsforschung unternehmen. Im letzten Fall kann man die Verwandtschaft unterschiedlicher Arten definieren.

Obwohl die DNA eigentlich sehr stabil ist, können an ihr häufig Schäden auftreten und zwar durch

  1. Fehler während der Replikation
  2. Chemikalien (z.B. Zigaretten, Alkohol)
  3. physikalische Faktoren

Diese Fehler werden in der Regel sofort wieder repariert. Nur wenn beide gegenüberliegenden Stellen einer DNA gleichzeitig geschädigt sind und Wasserstoffbrücken bilden können, fallen sie den Reperaturenzymen nicht auf und bleiben als Mutationen erhalten. Zu diesen Reperaturenzymen zählen auch Enzyme, welche die DNA aufschneiden und die beschädigten Stücke herausschneiden. Zu solchen Nukleasen zählen auch in den Bakterien vorkommende Restriktionsenzyme. Diese schneiden jede DNA, egal welche Herkunft an einer für jedes Restriktionsenzyme spezifische Abfolge von 4 bis 6 Nukleotiden auf und heraus. Die Spaltstelle dient dabei als Erkennungssequenz. Wichtigste Restriktionsenzyme darunter sind solche, die einen Doppelstrang versetzt aufschneiden und somit an jedem Doppelstrang einsträngige Enden liefern (sticky ends). Hier können künstliche Gene mit den gleichen komplementären einsträngigen Endstücken mit Hilfe von Polymerasenenzymen leicht eingebaut werden. Alle Restriktionsenzyme sind heute wichtige Werkzeuge bei der Untersuchung von Chromosomen und Genen in der Gentechnik. Die Restriktionsenzyme sind bei den Bakterien zum Schutz vor Virenbefall (deren DNA sie zerschneiden) entwickelt worden. Die bakterieneigene DNA wird nicht zerstückelt, da die Erkennungssequenz schützende Methylgruppen tragen.

Unterschiedliche Genaktivität und ihre Regulierung

Alle Zellen enthalten das gleiche Erbgut (außer Keimzelle). Trotzdem besitzen die verschiedenen Zellen unterschiedliches Aussehen und unterschiedliche Funktionen. Die Eigenschaften die die Gene bewirken sind so verschieden, dass zunächst kein Zusammenhang hergestellt werden konnte. Heute weiß man, dass die Gene der verschieden Zellen zu unterschiedlicher Zeit und in unterschiedlicher Reihenfolge angeschaltet werden. Dabei werden Gene in vielen Zellen übersprungen und nicht abgelesen. Andere Gene, welche in den entwicklungsgeschichtlichen Zusammenhang bereits abgelesen werden bleiben blockiert und können nicht mehr abgelesen werden. Die richtige Ablesung der Reihenfolge pro Zelltyp wird offensichtlich von Signalstoffen gesteuert, die zu Beginn einer Entwicklung eines befruchteten Eies von der Mutter geliefert werden und später von den Nachbarzellen des Keims. Die von der Mutter gelieferten Signalstoffe führen offensichtlich dazu, dass der Genpool eines Lebewesens von Beginn an abgelesen wird. Dies kann sogar bei differenzierten Zellen erreicht werden, die längst diese Frühstadien durchschritten haben. Diese Eigenschaft führt zur Möglichkeit des Klonens von Wirbel- und speziellen Säugetieren.

Diese Tätigkeit von Genen kann bei wenigen Tieren z.B. Zuckmückenlarven, Drosophila oder Maden direkt beobachtet werden, durch das sogenannte Auftreten der Puffs.

Moderne Möglichkeiten des gezielten Einflusses auf das Erbgut

Neben den bisherigen Möglichkeiten der Tier- und Pflanzenzüchtung nämlich

  1. einer intensiven Kombinationszüchtung vor allem mit homozygoten Inzuchtlinien
  2. mit Mutationszüchtung (durch gezielten Einsatz mutagener Stoffe) werden ungeheuer viel Mutanten erzielt, von denen einige wenige als positive Mutanten weitergezüchtet werden
  3. Züchtung vegetativ gewonnener Linien (sog. Klons)

werden heute moderne Methoden zur Erzielung hochwertiger Tier und Pflanzen angewandt.

Diese Methoden sind:

  1. Embryonenübertragung auf Ammenmütter
  2. Klonierung von hochwertigen Zuchttieren
  3. Klonierung von Zuchttieren mit künstlich geänderten Genen mit Eingriff in die Keimbahn
  4. Anwendung der Gentechnik:
    • in der Keimbahn
    • in normalen Somazellen
    • vielfach werden die oben genannten Methoden auch kombiniert.

Übertragung von Erbgut

Die wichtigsten Methoden zur Übertragung werden heute durch Kombination von Viren als Vektoren (Überträger) bzw. Plasmiden (Kreisvektoren) und von künstlichen Genen durchgeführt.

Zunächst muss das Gen welches übertragen werden soll in dem Genom, in dem es vorkommt identifiziert, dann isoliert werden, welche das Gen dann in die Fremdzelle einschleusen.

Wichtigste Arbeitsmaterialien sind die Restriktionsenzyme, welche die DNA in Fragmente mit einer Länge von bis zu 3000 Basenpaare spaltet. Bevorzugt werden dabei Restriktionsenzyme, die zu den sogenannten „sticky ends“ (klebrige Enden) führen, oder man hängt an die mit normalen Restriktionsenzymen zerschnittene DNA genau die selbe Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, mit dem der Vektor aufgeschnitten wurde. Beide, Passagier- DNA und Vektor, werden jetzt im Reagenzglas bei Temperaturen zwischen 33° und 37° problemlos mit Hilfe von Ligasen miteinander verbunden

In der Regel nimmt man heute als Vektor für Passagier- DNA, die in eukaryotische Zellen Zellen sollen eine Phagen- DNA. Soll ein Protein eines höheren Organismus aber in Bakterienzellen produziert werden, kann das entsprechende DNA- Fragment nicht einfach übertragen werden. Denn während bei Bakterien die Erbinformationen direkt in Proteine übertragen werden, sind die Gene der Eukaryoten durch Introns und Exons unterbrochen. In Folge dessen muss man hier unter Umgehung des genetischen Dogmas ( Information geht immer von DNA zu RNA und von dort zum Protein) von einer RNA ausgehen und ein künstliches Strukturgen herstellen. Daher isoliert man die betreffende fertige m- RNA aus einer Zelle, die solches produziert und stellt mit Hilfe der Reverse- Transkriptase den komplementären DNA- Strang dazu her (ohne die Introns). Anschließend wird die DNA mit Hilfe einer Ribonuklease abgebaut und der DNA- Einzelstrang mit den entsprechenden Enzymen zum Doppelstrang vervollständigt. Diese von einer RNA kopierte DNA wird copy- DNA oder c-DNA genannt.

Manche Passagier- DNA' s sollen nur vermehrt werden, um ihre Nukleotidsequenz festzustellen. Man benötigt sie allerdings in großen Mengen und ihre Vektoren werden Klonierungsvektoren genannt. Die andere DNA, von welcher Proteine abgelesen werden sollen, sitzen auf Expressionsvektoren. Solche Vektoren müssen aber daneben auch die entsprechenden Regulierungsenzyme enthalten, welche die betreffende DNA- Stelle an und abschalten (vgl. Produktion von Somatostatin).

Ein zweiter Weg zur Herstellung eines Gens ist die künstliche chemische Synthese von Genen. Dazu muss sie Aminosäuresequenz eines Proteins bekannt sein . Diese Methode ermöglicht die Herstellung von DNA, die in der Natur so nicht vorkommen. Da der genetische Code aber entartet, d.h. Bis zu 6 Codons für eine Aminosäure bestehen, gibt es keine absolute Korrelation zwischen Aminosäuresequenz und DNA- Sequenz. Dies wiederum ermöglicht eine große Varianz der DNA-Sequenz. Die man zur Optimierung des Gens nutzen kann. Auch diese künstliche DNA kann nach Anfügen von sticky ends als Passagier- DNA benutzt werden.

Anlage von Genbanken

Zur Analyse eines Gens benötigt man Milliarden Kopien des DNA- Stücks. Dazu wurden in den letzten Jahren mit der Entdeckung neuer Enzyme (siehe DNA- Polymerase) mehrere gute Methoden entwickelt. Das Genom eines Lebewesens wird mit Restriktionsenzymen in 3000- 10000 Nukleotide umfassende DNA- Fragment zerlegt. Diese werden jeweils in einen Vektor eingesetzt, von diesen als Passagier- DNA in Wirtszellen eingeschleust und dort mit jeder Teilung der Wirtszelle vermehrt (kloniert). So entstehen für jedes DNA- Fragment Zellklone mit identischen Fragmenten. Alle diese Zellklone zusammen nennt man Genbanken oder Genbibliotheken. Das menschliche Genom umfasst etwa drei Milliarden Basenpaare und wenn man annimmt, dass in jedem Vektor 3000 Basenpaare sind, so ergibt sich etwa eine Million Klone die nötig sind, um als Genbank des Menschen zu dienen.

Auswahl von Zellklonen

Aus dieser Menge von Klonen muss nun dasjenige Plasmid gesucht werden, welches das gewünschte Gen enthält. Daher wurden zunächst unsequenzierte aber schnell durchführbare Tests gemacht. Die Klonselektion besteht aus aufeinanderfolgenden Einzelstricken:

  1. Selektion derjenigen Klone, die Vektor-DNA enthalten
  2. Selektion derjenigen Klone, die neukombinierte DNA enthalten
  3. Selektion derjenigen Klone, die die gesuchte Phagen-DNA enthalten
  4. Selektion derjenigen Klone, die die gesuchte Phagen-DNA exprimieren

Selektion derjenigen Klone, die Vektor-DNA enthalten

Plasmide, die als Vektor verwendet werden, enthalten meist zwei Antibiotikaresistenzgene. Eines dieser Gene darf eine nur einmal vorkommende Restriktionsenzymschnittstelle besitzen. In diese Schnittstelle wird die Passagier- DNA eingebaut, das Resistenzgen dadurch inaktiviert.

Die andere Resistenzgenschnittstellebleibt enthalten un die Bakterien, in die der Vektor eingepflanzt wird, können nun in einem Medium wachsen, das mit den betroffenen Antibiotika versehen ist. Es können also nun in ein er Petrischale alle diejenigen Bakterien wachsen, welche das Gen mit der Resistenz enthalten. Es muss nur überprüft werden, welche dieser Klone die neukombinierte, gesuchte DNA aufgenommen haben. Hierzu versucht man das durch den Einbau der Passagier- DNA inaktiv gemachte zu überimpfen. Nämlich mittels eines Samtstempels das Muster der 1. Petrieschale auf weitere Schalen, in denen sich das Nährmedium das Antibiotikum befindet, welches das inaktivierte Gen produziert werden.

Formen, welche die Passagier- DNA enthält können in diesem Nährmedium nicht gedeihen. Durch Vergleich mit der Ursprungsplatte können die Klone gefunden werden, die die gesuchte DNA enthalten. Häufig handelt es sich bei den Passagier- DNA- Stücken um unterschiedliche Fragmente einer zu untersuchenden DNA. Es muss also noch der Klon gefunden werden, der das gesuchte richtige Gen enthält. Dazu gibt es heute unterschiedliche Methoden unter anderem die im Buch erwähnte Methode des Expremierens des Somatostatins.

Vier grundlegende Verfahren sind besonders wichtig:

  1. Koloniehybridisierung
  2. Hybridisierung Southern
  3. Identifizierung des Genprodukts anhand seiner enzymatischen Aktivität
  4. Identifizierung mit Hilfe immunologischer Methoden, indem das Genprodukt als Antigen mit den spezifischen Antikörpern reagieren

Die beiden ersten Verfahren beruhen auf eine Doppelstrangbildung (Hybridisierung) der gesuchten DNA mit einer zugeführten, radioaktiv markierten, komplementären DNA oder RNA.

Zu 4. Bedingung:

ist, dass die untersuchte Passagier- DNA aktiv ist, d.h. Ein Produkt expremiert. Gegen dieses Produkt, ein Protein, werden Antikörper hergestellt. Diese Antikörper werden an eine Plastikfolie adsorbiert (angebunden). Auf diese werden die verschiedenen Klone nach Zerstörung der Zellen aufgebracht. Hat ein Klon das gesuchte Produkt hergestellt, dann reagiert es mit dem Antigen. Zur Identifizierung dieser Antigen- Antikörper- Komplexe wird zusätzlich ein radioaktiv markierter Antikörper eingesetzt, der ebenfalls an das Antigen flankiert und kann so mit Hilfe eines Autoradiogramms leicht identifiziert werden. Nach Isolierung des DNA- Fragments kann dieses durch Klonierung großer Mengen vervielfacht werde.